食品種類很多,食品中pro 的性質和含量各不相同,而且其他成分,如碳水化合物,脂肪和維生素的干擾成分很多,因此pro 的測定通常利用經典的凱氏定氮法將樣品消化成銨鹽蒸餾,用標準酸液吸收,用標準酸或堿液滴定,由樣品中含氮量計算出pro 的含量。由于食品中pro含量不同又分為凱氏定氮常量法、半微量法和微量法,但它們的基本原理都是一樣的。我們在檢驗食品中pro 時,往往只限于測定總氮量,然后乘以pro 核算等數,得到蛋白質含量,實際上包括核酸、生物堿、含氮類脂、葉啉和含氮色素等非蛋白質氮化合物,故稱為粗pro 。

不論常量、半微量以及微量定氮法它們的原理都是一樣的,首先第一個步驟是消化:樣品與硫酸一起加熱消化,硫酸使有機物脫水。并破壞有機物,使有機物中的C、H 氧化為CO2 和H2O 蒸汽逸出,而pro 則分解氮,則與硫酸結合成硫酸銨,留在酸性溶液中。在消化過程中添加硫酸鉀可以提高溫度加快有機物分解,它與硫酸反應生成硫酸氫鉀,可提高反應溫度,一般純硫酸加熱沸點330 ℃,而添加硫酸鉀后,溫度可達400 ℃,加速了整個反應過程。此外,也可以加入硫酸鈉,氫化鉀鹽類來提高沸點。其理由隨著消化過程硫酸的不斷地被分解,水分的逸出而使硫酸鉀的濃度增大,沸點增加。加速了有機的分解。但硫酸鉀加入量不能太大,否則溫度太高,生成的硫酸氫銨也會分解,放出氨而造成損失。

為了加速反應過程,還加入硫酸銅,氧化汞或硒粉作為催化劑以及加入少量過氧化氫,次氯酸鉀作為氧化劑。但為了防止污染通常使用硫酸銅。所以有機物全部消化后,出現硫酸銅的蘭綠色,它具有催化功能,還可以作為堿性反應指示劑。

1.1 　蒸餾

樣液中的硫酸銨在堿性條件下釋放出氨,在這操作中,一是加入氫氧化鈉溶液要過量,二是要防止樣液中氨氣逸出。吸收與滴定:蒸餾過程中放出的氨可用一定量的標準硫酸或標準鹽酸溶液進行氨的吸收,然后再用標準氫氧化鈉溶液反滴定過剩的硫酸或鹽酸溶液,從而計算出總氮量。半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后,再用標準鹽酸直接滴定,硼酸呈微弱酸性,用酸滴定不影響指示劑變色反應,它有吸收氨的作用。

1.2 　操作步驟

準確稱取樣品中(0.50～2.00) g →于500ml 凱氏瓶中→加10g 無水K2SO4 →加0.5gCuSO4 →加20mlH2SO4 →在通風櫥中先以小火加熱,待泡沫消失后,加大火力,消化至透明無黑粒后,將瓶子搖動一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中→繼續消化30 分鐘→至到樣液呈綠色狀態,停止消化,冷卻→加200ml 水→連接蒸餾裝置→用硼酸作吸收液→在K 氏瓶中加波動珠數粒和80ml50 %NaOH →立即接好定氮球→加熱→至到K氏瓶內殘液減少到三分之一時,取出用水沖洗→用0.1N HCl 滴定。

計算:總氮量% = ( N ( V2 - V1) ×0.014) / W ×100

0.014 ———氮的毫克當量數

pro % = 總氮% ×K

乳制品K = 6.38 ( N = 15.7 %)

小麥粉K = 5.79 ( N = 17.6 %)

動物膠K = 5.6 ( N = 18.0 %)

冰蛋K = 6.7 ( N = 14.8 %)

大豆制品K = 6.0 ( 16.7 %) 　K = 6.25 則( N =16 %)

K - 換稱等數

1.3 　各種試劑的作用

濃H2SO4 : (1) 脫水使有機物炭化,然后有機物炭化生成碳,碳將H2SO4 還原為SO2 ,本身則變為CO2 。(2)氧化。(3) pro 與濃H2SO4 生成NH3 ↑,CO2 , SO2 , H2O↑。(4) NH3 與H2SO4 生成硫酸銨。

CuSO4 :催化劑,CuSO4 為紅色沉淀,當C 完全消化后,反應停止,紅色消失,變為蘭色,即為消化達到完全,蘭色為CuSO4 的顏色。K2SO4 :提高沸點,沸點由330 ℃提高到400 ℃加速了反應過程。

下面就幾方面來說明影響氨化完全與否和速度快慢的因素:

(1) K氏燒瓶和取樣量

如果稱1g 以上的樣品, 就需要K 氏燒瓶最小500ml , (800～1000) ml 的更好,這樣的K 氏燒瓶對于縮短氨化時間,加熱的均勻性和完全氨化效果最好。

(2) 分解劑

H2SO4 和K2SO4 的添加量。有機無分解需要H2SO4 量,H2SO4 應根據有機物種類不同而加的量就不同,如果試樣含脂類高,則加H2SO4 多,為了提高分解溫度,要大量添加K2SO4 ,但不能太多,也不能太少,太少則氨化不充分。K2SO4 和H2SO4 的添加比例是:1g 樣品　K2SO4 : H2SO4 = 7g :12ml這種比例在國內外都使用,是公認的還有一種比例: K2SO4 :H2SO4 = 10 :20ml

(3) 催化劑

用作催化劑的有Hg、HgO、Se , 硒化合物, CuSO4 、TiO2 ,對Hg ,HgO 有毒但結果好,Se 與CuSO4 得到結果是一種,TiO2 ,的結果偏低,采用不同的催化劑則消化時間不同, HgO 消化麥子為38 ,Se 與CuSO4 消化麥子55 ,TiO2 消化麥子70 ,所以在給出測定結果時要注明催化劑的類型。

(4) 熱源的強度

消化時熱源的強度同迅速消化和完全氨化關系很大,即便鹽類K2SO4 加得多,如果熱源弱,也是沒有意義的,熱源過強導致H2SO4 損失,使氨回收率低,另外K氏瓶的容量大小,頸部的粗細和長短等,也與熱源的強度有關。

(5) 氨的蒸餾和吸收及滴定

蒸餾有兩種:直接蒸餾(裝置簡便,準確性好) 和水蒸汽蒸餾。蒸餾加NaOH 是50 % ,加的量為H2SO4 量的4倍,硫酸量為12ml ,則NaOH 為12 ×4 = 48ml ,而且一般高于這個理論值,即加到(50～55) ml ,如果NaOH 量加的不夠就變成H2S , H2S 是強酸,使顏色變紅。吸收液有:標準H2SO4 ,用標準堿返滴定,甲醛紅指示劑;硼酸,用HCl 進行滴定,混合指示劑。目前都用硼酸吸收液,用硼酸代替H2SO4 ,這樣可省略了反滴定, H2SO4 是強酸,要求較嚴,而硼酸是弱酸,在滴定時,不影響指示劑變色范圍,另外硼酸為吸收液濃度在3 %以上可將氨完全吸收,為保險期間一般用4 %。

1.4 　實驗注意事項

(1) 樣品應是均勻的,若是固體樣品應事先研細,液體樣要混合均勻。

(2) 樣品放入K氏燒瓶時,不要黏附瓶頸上,萬一黏附可用少量水緩慢沖下,以免被檢樣消化不完全,使結果偏低。

(3) 消化時,如不容易呈透明溶液,可將K氏燒瓶放冷后,加入30 %過氧化氫催化劑(2～3) ml ,促使氧化。

(4) 在整個消化過程中,不要用強火,保持和緩的沸騰,使火力集中在K 氏燒瓶底部,以免附在壁上的蛋白質在無硫酸存在的情況下,使氮有損失。

(5) 如硫酸缺少,過多的硫酸鉀會引起氨的損失,這時會形成硫酸氫鉀,而不與氨作用,因此當硫酸過多底物被消耗掉或樣品中脂肪含量過高時,要添加硫酸量。

(6) 混合指示劑在堿性溶液中呈綠色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈紅色,如果沒有溴甲酚綠,可單獨使用011 %甲醛紅乙醇溶液。

(7) 氨是否完全蒸餾出來,pH 試紙檢查餾出液是否為堿性。

(8) 向蒸餾瓶中加入濃堿時,往往出現褐色沉淀無。這時由于分解促進劑與加入的硫酸銅反應,生成氫氧化銅,經加熱后又分解生成氧化銅的沉淀,有時Cu 離子與氨作用生成深蘭色的絡合物。

(9) 消化劑綠色后繼續消化30min 即可。

二者原理相同,操作方法大同小異,半微量法消化后,定容100ml ,然后吸25ml 蒸餾吸收液吸收。計算總氮% = ( N ( V 2 - V 1 ) ×01014) / ( W ×10/100) ×100

對于微量定氮儀法,儀器有了改進,樣液稱樣少,蒸餾消化液也少,其它基本一樣。

原理與上面一樣,儀器,采用K氏自動定氮儀:其裝置內具有自動加堿蒸餾裝置,自動吸收和滴定裝置以及自動數字顯示裝置,消化裝置:由優質玻璃制成的K 氏消化瓶以及紅外線裝置的消化爐。