飼料蛋白質含量的測定通常采用國標規定的凱氏定氮法, 但用雙縮脲比色法測定飼料中蛋白質含量也有報道( 陳革, 2003) 。本實驗對多種飼料樣品采用雙縮脲比色法進行蛋白質含量測定,并將結果與凱氏定氮法進行對比和分析, 為實際工作中選擇合理的方法進行飼料中蛋白質含量的測定提供科學依據。

1 雙縮脲法原理

當尿素加熱至150 ～160 ℃時, 可由兩個分子間脫去一個氨分子而生成二縮脲( 也叫雙縮脲) 。其反應式如下:2H2NCONH2→H2NCONHCONH2 +NH3↑雙縮脲在堿性溶液中與硫酸銅反應生成紫紅色的絡合物, 此反應稱為雙縮脲反應。含有2 個或2 個以上肽鍵的化合物都具有雙縮脲反應。由于蛋白質分子中含有多個肽鍵( - CO- NH- ) , 在堿性溶液中與銅離子絡合成紫紅色絡合物, 在一定條件下其顏色深淺與蛋白質含量成正比。據此可用吸收光度法測蛋白質含量, 該絡合物最大吸收波長為540 nm。

2 實驗材料

2.1 試劑雙縮脲試劑:稱取CuSO4·5H2O 1.5 g,酒石酸鉀鈉(NaKC4O6·4H2O) 6 g, 溶于500 mL 蒸餾水, 在攪拌下加入300 mL 質量分數10 %NaOH 溶液, 然后用蒸餾水稀釋到1000 mL。配好后貯于塑料瓶中。蛋白質標準溶液( 7 g/100mL) , 10 %氫氧化鉀溶液: 稱取分析純氫氧化鉀50g 溶于500 mL 蒸餾水中。

2.2 主要儀器 粉碎機; 分樣篩: 孔徑0.45 mm( 40 目) ; 751 紫外/可見分光光度計; 電熱恒溫水浴鍋; 分析天平: 感量0.0001 g; 電爐; 玻璃燒杯;具塞玻璃試管: 25 mL; 容量瓶; 托盤天平，比色計，羅維朋比色計等。

3 測定方法

3.1 標準曲線繪制將蛋白質標準液( 7 g/dL) 用0.1 mol/L NaOH 溶液稀釋至4 mg/mL。分別取蛋白質標準液( 4 mg/mL) 0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于25 mL 具塞比色試管中, 用蒸餾水補齊至1.0mL, 然后各比色管中加入4.0 mL 雙縮脲試劑, 混勻, ( 37±0.2) ℃保溫30 min。以空白管調零, 用751 型分光光度計在540 nm 波長, 杯徑1 cm, 測定吸光值。以蛋白質含量(mg/mL) 為橫坐標, 以吸光值為縱坐標作標準曲線, 如圖1 所示。

3.2 飼料中蛋白質的測定

3.2.1 樣品來源飼料市場采集的具代表性飼料樣品10 個。

3.2.2 樣品處理將樣品粉碎后經40 目篩過濾, 準確稱取0.2 g( 精確至0.0002 g) 飼料樣品于具塞試管中, 加入10 % KOH 溶液10 mL, 沸水浴30 min, 冷卻后用蒸餾水定容至25 mL, 過濾。取飼料過濾液0.5 mL, 以蒸餾水補齊至1.0 mL, 加4.0 mL 雙縮脲試劑, ( 37±0.2) ℃反應30 min。以空白管調零, 在540 nm 處測定吸光值, 依據標準曲線, 求得濃度值。計算公式如下:飼料樣品蛋白質含量(%) =C×2×25/W×1000。式中, C 為經標準曲線求得的濃度值(mg/mL) ;W為飼料樣品重量( g) 。

4 結果與分析

4.1 不同飼料樣品的對比實驗結果見表1。從表1 可以看出, 雙縮脲法對飼料蛋白質含量的測定結果與凱氏定氮法測定結果, 相差較大, 比凱氏定氮法所測值低15.1 %( 5.8 % ～31.7 %) 。孫建平和侯彩云( 2005) 認為雙縮脲法的測定結果比凱氏法小10 % ～20 %。凱氏定氮法測得的蛋白質含量是粗蛋白質, 即含氮量乘以6.25, 其中包括無機氮和氨基酸。雙縮脲法測得的蛋白質含量是真蛋白質。是堿溶液所能溶解的蛋白質, 并且與雙縮脲反應轉為絡合物的顯色部分; 而不溶解的那一部分蛋白質和雙縮脲試劑的反應很少, 即使有反應, 產生的有色絡合物經過濾并不存在于最終的比色液中。因此, 比色測定中讀出的吸光度值, 只是可溶蛋白質形成的有色絡合物的吸光度值。另外, 飼料中添加的蛋白質原料較為復雜, 有豆粕、花生粕、棉籽餅、菜籽餅、魚粉、羽毛粉等。測定中雖經過粉碎、過篩、堿液煮沸, 但有些蛋白質仍難溶于測試液中, 與真實值相比產生較大誤差。并且飼料中含有大量的粗纖維, 對于粗纖維含量較高的樣品, 雙縮脲法測定結果不十分穩定。

4.2 在牛奶、豆漿、牛血清中的對比實驗結果見表2。從表2 可以看出, 利用雙縮脲法測定牛奶、豆汁、牛血清蛋白質含量與凱氏法測定結果較為接近, 因為這些樣品中所含蛋白質溶解度較高,所含蛋白質種類相對較少, 其性質與標準蛋白液接近。

4.3 雙縮脲法測定飼料蛋白質含量精密度實驗對5 號、6 號飼料樣, 分別取6 個樣品用雙縮脲法測定蛋白質含量, 結果見表3。從表3 可以看出,雙縮脲法對同一飼料樣品的平行測定結果, 重現性較好, 精密度較高。符合國標規定蛋白質測定結果的相對偏差范圍, 但平均值與凱氏法結果差距較大。

5 小結

雙縮脲法測定飼料蛋白質雖然不經消化, 不產生有害氣體, 但并不省時。飼料中淀粉經堿溶液及加熱處理而糊化, 難以過濾, 尤其配合料淀粉含量高, 2 h 只能過濾1 ～2 mL( 濃縮料相對較快) ,且此法受工作環境( 溫度等) 影響較大, 若每次作標準曲線就更費時。飼料中成分復雜, 某些離子對顯色反應會產生影響, 這也是結果不穩定的原因。

綜上所述, 雙縮脲法不適于配合飼料和濃縮飼料蛋白質含量的測定。